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- 基因芯片在植物病菌检测仪中的应用
来源：http://www.zhibao17.com/ 更新时间：2012-12-19 阅览7176次
- 1引言
自20世纪90年代研发微阵列芯片以来，以基因芯片为主的微阵列芯片技术得到了大量的关注，并开始应用于医学及其他生命科学的研究。因“基因芯片”已被Al场metrix公司注册，许多文章或公司在生产产品时都用DNAmicroarray或DNAchip著称。基因芯片技术是集分子生物学、生物化学、物理学、计算机科学为一体的高新技术。目前，基因芯片大多用于与基因表达谱测定、基因组文库作图及杂交测序、基因突变检测、基因多态性分析等，为医学诊断和其他生命科学领域的发展提供了强而有力研究手段，将带来新基因的发现、基因诊断、病害诊断、药物筛选等方面的蓬勃发展和重大突破，进而将对整个人类社会的发展产生巨大影响。基因芯片应用于植物病菌检测仪，对环境科学的研究方法可以作为植物病害诊断的参考依据，对植物病害和外来人侵生物防治工作有着重要的指导意义。
2基因芯片的类型
基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列，是专门用于核酸检测的生物芯片，也是目前运用最广泛的微阵列芯片。它是指在固相载体上按照待定的排列方式固定上大量序列已知的DNA片段，形成DNA微矩阵川。基因芯片的发展与蓬勃依赖于探针固相原位合成技术、高分子合成技术、照相平板印刷技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术的出现和发展，正是这些技术的推动才使基因芯片得以从实验室研究平台走向市场。
基因芯片的按照合成方法差别主要分为6种类型：原位光化学合成芯片、原位喷墨合成芯片、点样法合成芯片、电子芯片、三维芯片、流过式芯片。原位光化学合成芯片、原位喷墨合成芯片和点样法合成芯片是主要的3种应用芯片类型。原位合成芯片是Affy-metrix公司研发的，是较早应用于芯片合成的技术。微量点样技术是目前应用较广的一项芯片合成技术，许多生物科技公司都生产这项技术设备，该技术的出现成功得地提高了芯片技术的高通量性。电子芯片是由美国Nanogen公司开发的，后来日本学者KazuoGoto研发电化学芯片，并应用与梭菌和螺杆菌和小鼠肝炎病毒的检测，我国目前也在开发这项技术，该技术的最大特点是分析速度快，但该技术制备较为复杂，成本也较高。三维芯片是目前许多公司开发的热点，其优点是可以节约每次操作的成本并减少操作步骤，该芯片应用于蛋白微阵列设计具有很好的应用前景。流过式芯片是GeneLogic开发的芯片技术，具有敏感性高、速度快、成本较低等特点。
基因芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化，可以在IC耐的载体表面固定数以万计的探针分子，然后对获得的信息进行同步快速的全自动分析。另外，由于基因芯片上探针定位的精确性及信息的可知性，可以利用芯片进行靶基因不同状态及单个碱基的分析。
3微阵列芯片的研究应用策略
基因芯片最初研发应用于监测基因表达和检测DNA序列的变异，后来被用来高通量检测并确认环境或临床样本。应用基因芯片技术进行临床诊断已有不少文献报道。随着基因芯片技术的发展，基因芯片技术在环境样本，尤其是水样本中致病菌的诊断分析的应用不断增加。应用于诊断植物病害的基因芯片也开始有所报导。虽然，相关的文献层出不穷但是基因芯片技术的发展仍然较为缓慢，这除了受限于其昂贵的制作成本及设备还受目前研究水平尤其是靶标基因的特异性和敏感性的限制。因此，为了更好地应用基因芯片技术进行植物病害诊断研究，确定研究策略是至关重要的。
3.1墓于rRNA基因为探针的研究策略
核糖体RNA基因存在于所有细胞生物中并具有相同的起源和功能，因而可以反映所有物种间具有可比性的进化史。而且rDNA中有些片段具有高度的序列同源性或保守性，从而可为不同物种间的系统学比较提供研究参考点。
自white等首次设计通用引物ITsl和rl，斜并用于扩增真核生物核内核糖体RNA基因以来，ITS大量应用于真核生物种间及种内鉴定分析。大量科学工作者应用ns来确定各种生物的分类地位。应用I作及大亚基285rDNA基因鉴定在中国四川雀儿山发现的使昆虫致病的线虫新种及巴西新种线虫。大量的文献报道，应用I作作为分子标记来鉴定作物(如葡萄、辣椒、黄瓜、马铃薯、番茄)上的病菌发生类型，这些工作不仅仅证实了ITS应用于分类的意义，也丰富了特异性扩增作物病菌的引物多样性。鉴于ITS在分子诊断上的意义，应用ITS文库设计DNA微阵列分析并诊断兰科菌根真菌。Bia。su。成功应用IGs区基因设计探针监测食物引起致病菌，从而提供了重要的致病毒性相关的基因型信息。
应用于细菌分类鉴定的核糖体RNA基因有165rRNA基因、235rRNA基因及165-235：RN^基因间隔序列。许多文章应用rRNA基因设计基因芯片对细菌的诊断分析。等应用235rRNA基因设计微阵列监测水中细菌。IsR进化速率比165：RNA大10倍，在细菌的不同属、种中拷贝数、碱基排列顺序以及内含的tRNA基因的数量和种类表现差异，ISR序列大小比165rRNA序列更具直接测序优势，PcR后电泳显示基因间隔序列多样性和序列分析可鉴别细菌属。se-ungMi。Yoo等应用IsR作为探针设计基因芯片检测细菌。
3.2基于EST为探针的研究策略
EST表达序列标签，来自mRNA的eDNA拷贝的短J字DNA序列，它与mRNA互补，可用来鉴定对应于mRNA的基因上。EsT用来鉴定微生物已成为一项比较成熟的技术，NCBI中EST文库数据的不断增多为EST应用与基因芯片技术提供了信息数据支持。但是，许多关于应用EST来设计基因芯片技术并进行监测的文章大多与动物门生物相关，应用于植物及微生物的文章鲜少。
3.3基于基因组ONA及功能基因为探针的研究策略
比较基因组杂交研究可以通过分析在基因组水平上不同微进化事件的表现进而分析一组同属或同种生物的遗传相关性。应用比较基因组基因设计基因芯片应用于高通量监测食物传染病原菌，研究表明基于基因组DNA设计的基因芯片检测食物传染病原菌具有高特异性，证明该方法应用于监测食物传染病原菌具有可行性。此外，以功能基因设计的基因芯片可开始应用于许多生物的监测或鉴定，常见的有以召了rB基因(编码细菌旋转酶的B亚单位的基因)为靶标基因设计微阵列鉴定环境样本和水样本中的细菌。gyrB基因是一种蛋白编码基因，在大多数细菌中发现，该基因的进化速率比rRNA基因和其他蛋白编码基因快，可用于许多细菌鉴定。功能基因h咧亦常用于监测该属微阵列设计中。对于不同细菌的功能基因不同，可用于监测的基因种类繁多，许多文献也有相关报道。大部分病原细菌的不同小种的致病性不同，这种差异与具有选择优势的细菌寄生模式致病因子相关，因此，通过检测编码致病因子的基因可以有效鉴定并区分细菌病原菌。
4作为探针的基因的选择及限制性
设计寡核昔酸微阵列芯片的关键在于选择合适的探针。事实上，在选择探针是有3项原则必须要考虑：所有的探针必须对靶标基因有非常高的特异性并避免与非靶标基因产生交叉杂交，简而言之即特异性；其次，探针必须有较高的敏感性，可以检测到低丰度的杂交信号；最后探针必须拥有相同的热力学性质，这样才能保证相似的杂交行为。
本文所述的探针可根据不同的科研或工作需要作以相应选择，探针在研究不同对象有各自的优越性，但是，由于目前研究基础的限制，各种探针也都有其相应的缺陷性。
rRNA基因用于做探针设计微阵列来研究真菌和细菌其优越性表现在。RNA文库的信息较多，对该基因应用于鉴定真菌和细菌的研究较为成熟，但是，由于该基因在进化过程中的保守性，相应地用于基因芯片研究也会产生许多基因不能检测到种的差别的缺点。EsT作为探针其优越性与rRNA基因相似，也有其较广泛的信息来源，但是，EST用于微阵列设计大多应用于动物门生物的研究。基因组DNA和功能基因作为探针的缺陷在于其自身研究的透彻性，若该基因应用与鉴定或监测已有相应较好的研究基础，其应用于微阵列设计监测靶标基因也会产生较好的结果。 对于探针长度的设计，许多科研工作者也总结出了一些经验。探针寡核昔酸的长度在探针对靶标基因的检测限起着至关重要的作用。短探针更易于检测到错配的位置，因此更适用于rRNA等微阵列。而长探针表现出了高敏感性但较差的特异性。
5基因芯片技术在植物病害的应用与展望
由于大量使用高毒农药引起许多生态多样性问题，有害生物综合防治这一概念得到了许多植保工作者的推崇，然而，IPM的发展受到了缺乏短时间内快速、准确、可靠地检测、鉴定并定量有害生物的限制，因此，在植物病害诊断方法中引人基因芯片技术可以高通量、快速检测有害生物，从而为防治有害生物提供生物学依据。
基因芯片技术由于其昂贵的价格，目前为止，仍主要应用于临床医学诊断人体基因变异导致病害，只有少量应用在其他学科实验室研究。首次报导应用cDNA芯片技术检测植物病毒，其研究发现应用微阵列技术设计用于检测4种葫芦科植物病毒的芯片具有较高的特异性，对靶标基因产生较强的杂交信号并对非靶标基因产生弱信号或不产生信号。随后，等应用基因芯片监测栗疫病菌低毒性病毒的转录反应。11基因作为靶向基因设计微阵列芯片用于检测植物病原真菌辣椒立枯丝核病菌及生防菌哈茨木霉。设计微阵列以用于检测细菌和分析微生物群体结果表明基于基因组的微阵列技术作为特异、灵敏、高通量地监测、鉴定、描述自然环境微生物的一项技术具有巨大的发展潜力。设计寡核昔酸基因芯片用于检测马铃薯病毒，并用EusA分析及随后的RT—PCR扩增测序进行验证，结果表明该方法用于检测多种病毒同时感染的样本快速有效。
基因芯片技术诊断植物病害的报道并不多，这也意味着该技术应用于农作物病害检测仪，对于植物病害诊断有较大的发展潜力，但是，基因芯片技术应用于植物病害的普及仍有许多瓶颈，其主要表现在：芯片制造成本较高，短时间内只能应用于实验室研究；基因芯片技术自身易产生非特异性杂交信号干扰研究结果的真实性；应用与植物病害诊断基因文库的信息仍需要不断完善与补充。因此，将基因芯片技术引进到植物病害诊断研究中将带来植物病害诊断的重大发展和突破，但是，为了取得工作上的重大进步，许多工作仍需我们不断完善。
