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农药害虫抗药性监测的现状及方法

来源:http://www.zhibao17.com/ 更新时间:2012-12-04 阅览5841次

      随着有机合成农药的发展,化学农药在农业害虫防治中起到非常重要的作用,而化学农药普遍、大量使用,导致害虫抗药性问题越来越突出。据文献报道,产生抗药性的害虫种类1960年为137种,1980年为432种,1989年为600种,抗药性害虫对农业生产所造成的损失越来越严重。有研究认为,抗药性是昆虫自身的一种遗传性状,其抗性基因本身就存在于昆虫体内,参与体内的各种代谢过程。实际上,人类从事的农业生产活动很大程度上影响和控制着害虫抗药性的发展速度和严重程度。要了解害虫抗药性水平须首先建立一套准确而易于操作的抗药性监测与检测方法,才能正确了解害虫抗药性发生程度和进一步研究其抗性机制。通过害虫抗性监测,可以及时准确地掌握害虫抗性水平及其分布,明确重点保护的药剂类别及品种,对整个治理方案的治理效果进行评估,为抗性治理方案的修订提供依据。 近年来,分子生物学研究手段和方法不断进步和完善,并应用到昆虫抗药性的分子机理研究中,促进了农业害虫抗药性监测方法朝多元化方向发展。
1农业害虫抗药性监测应用现状
      1939年,第1种杀虫剂DDT在全球范围内被广泛使用,1946年首次发现昆虫对DDT的抗药性。70年来,随着杀虫剂种类的增加和广泛使用,具有抗药性的昆虫种类不断增加,已引起人们越来越多的关注。为了阻止和延缓害虫抗药性的产生、减少农药使用量、延长新农药的使用寿命,加强害虫抗药性监测迫在眉睫。目前国内已有多家科研单位对飞虱、螟虫、甜菜夜蛾、蚜虫、棉铃虫、小菜蛾、马尾松毛虫等进行了抗药性监测。张晓婕等采集浙江省不同地区的灰飞虱,监测了其对吡虫啉、氟虫腈和毒死蜱的抗药性水平。施德应用稻茎浸渍法测定了浙江地区褐飞虱对主要防治药剂的抗性水平。
李文红等监测了l996~2007年间我国8省(区)27个褐飞虱种群对噻嗪酮的敏感性。 陈长琨等对用于二化螟抗药性监测的虫态进行了探索,确定4龄幼虫较适合作为二化螟抗性监测虫态,并建立了6种药剂的相对敏感基线。曹明章等采用点滴法测定了2001~2002年浙、苏、皖、赣等4省水稻二化螟4龄幼虫对氟虫腈、阿维菌素、三唑磷及杀虫单等的抗性。 吕亮等监测了湖北省4个稻区的二化螟和三化螟在2005~2007年间对三唑磷、阿维菌素的抗药性。兰亦全等采用微量点滴法测定了福建福州建新、闽侯上街、南平建欧、厦门同安、莆田黄石和漳州龙海等地6个甜菜夜蛾田间种群4龄幼虫对6种代表性药剂的抗性,比较了3种新型药剂对6个田间种群的毒力。 据陈根等报道,福州市建新和闽侯县上街田间菜缢管蚜种群对甲胺磷、毒死蜱、氯氰菊酯、氰戊菊酯和阿维菌素均已产生高抗性,对吡虫啉的抗性为中等水平;对丁硫克百威相对较敏感。
      吴益东等用浸叶法建立了11种棉铃虫常用药剂的敏感毒力基线,确定其LC50值和区分剂量,并用浸叶法监测了江苏、山东、河南、安徽4省棉田2代棉铃虫对氯氰菊酯、久效磷、灭多威和辛硫磷的抗性。龙丽萍等采用叶片浸渍法测定了广西小菜蛾在2000~2003年对定虫隆敏感性的动态变化情况。
2农业害虫抗药性监测方法
      长期以来,对有害生物的抗药性监测一直采用基于敏感度的生物测定检测方法。20世纪80年代末期以来,分子生物学研究极大丰富了人们对生命过程和本质的认识,昆虫学各分支学科的研究已逐渐推进到分子水平,一系列新的研究方法和技术开始应用于昆虫抗药性研究领域,如生化检测法和分子生物学检测法等,极大丰富了抗药性监测的途径。
2.1生物检测法
      目前对杀虫剂抗药性的标准生物测定方法有浸渍法、药膜残留法或表面接触法、点滴法和饲喂法4种,选择何种方法进行测定要根据药剂的作用特点及理化性质、害虫的为害特点及其他生物学特性等确定,必要时可进行适当的改进。 吴益东等比较了点滴法和浸叶法监测棉铃虫的抗药性,指出对有机磷杀虫剂采用浸叶法作抗性监测更准确。曾晓芃等在比较德国小蠊抗性测定方法时指出点滴法较药膜法更为灵敏,能较为准确地反映德国小蠊的实际抗性水平。Watkinson等(1984)研制了一种测定害虫对杀虫剂敏感度的浸渍试验箱,采用该方法一般可在24 h内得出结果。
      生物检测法是通过比较实验室种群(相对敏感种群)和田间种群(抗性种群)的LD50或剂量-反应曲线(LD-Pline)的斜率来描述的,因此也称为抗性倍数法。该方法存在以下局限性:(1)在抗性个体频率较高时检测效果很好,但在某些种群初次出现少数抗性个体时,获得的结果总是滞后于抗性的发展速度,不适合早期检测;(2)需要大量活的虫体,花费时间长,占用空间大;(3)从虫源、饲养到测定难于做到真正的标准化;(4)不能测出抗性机制。
2.2 区分剂量法
      区分剂量法是用抗性个体百分率来表示抗性水平高低,标定准确的区分剂量能监测到群体中初次出现的少数抗性个体,比用抗性倍数法更能及时准确地对抗性早期作出诊断, 起到早期预警作用。区分剂量的适当与否直接关系到抗性检测的准确性。如区分剂量偏低,会夸大抗性的程度;区分剂量偏高,则会掩盖抗性的真实情况。Roush等认为,较好的方法是用杀死大约99%敏感个体的剂量作为区分剂量,这样允许很少敏感个体存活而几乎不杀死大多数在更高剂量下可能死亡的抗药性个体。
沈晋良等报道,棉铃虫抗性个体存活率随抗性水平的上升而增加,当棉铃虫对拟除虫菊酯类农药处于敏感阶段(1985~1987年)、敏感性降低(1988年)和低至中等水平抗性(1989年)时,抗性个体的存活率分别为0%~6%、10%~11%和18%~63%,并指出该方法与常规抗性监测法的结果是相符的。
2.3生物化学检测法
      害虫抗药性的生化机制表明,害虫抗药性通常与解毒酶对杀虫剂的解毒能力增强或靶标酶对杀虫剂的敏感性降低有关,这是害虫抗药性生物化学监测的理论基础。生物化学检测法是通过检测单个害虫的生化抗性机制来检测害虫抗药性。与传统生物测定方法相比,生物化学检测法具有快速、准确、可对单头昆虫进行多种分析等优点。目前,害虫抗药性的生物化学监测主要是酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和多功能氧化酶系等3种解毒酶及杀虫剂作用靶标乙酰胆碱酯酶敏感性下降相关的抗药性监测。
2.3.1 酯酶
      酯酶在昆虫抗性机理中有两种解毒作用,一是水解作用,催化酯键断裂;另一种是作为结合蛋白与杀虫剂结合,减少到达靶标的量。 在许多情况下酯酶水平的提高,能有效降解杀虫剂。 酯酶活力可用α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯作底物测出,二者分别被水解为α-乙酸萘酚和β-乙酸萘酚,再以坚固蓝B盐为显色剂, 利用分光光度计分别在600nm和555nm波长下测定光密度值(A)。Delorme等报道甜菜夜蛾抗溴氰菊酯品系对溴氰菊酯的降解速率是敏感品系的17倍,抗性品系酯酶活性比敏感品系高得多。 谭维嘉等指出,棉蚜对溴氰菊酯的不敏感性与水解酶(即酯酶)之间存在一定相关性, 随着棉蚜对菊酯类杀虫剂不敏感性的增加,棉蚜体内水解酶的活力也有所增高。赵颖等比较了不同抗性品系棉蚜体内羧酸酯酶对α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯的水解活性后指出,抗性品系的羧酸酯酶比活力明显高于敏感品系。曾晓芃等研究了德国小蠊敏感品系和抗性品系羧酸酯酶(CarE)生化性质上的差异, 发现德国小蠊抗性品系中的CarE活性高于敏感品系中的CarE活性, 敏感品系CarE对α-乙酸萘酯的亲和力大于抗性品系 CarE。Devonshire等发现与抗性相关的“E4”酶量随着抗性程度的增高而以几何级数的方式上升。 吴兴富等发现α-乙酸萘酯羧酸酯酶的酶活力及其抗性个体频率的增加是40%氧化乐果和2.5%功夫连用后烟蚜抗药性快速发展的主要原因。
2.3.2 谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)
      谷胱甘肽转移酶(GSTs)是能够将底物中的基团转移到内源性还原型谷胱甘肽(GSH)硫原子上的一类酶,这些酶的功能是使有毒的亲电试剂与内源性的GSH扼合而保护其他亲核中心,在对外源杀虫剂解毒代谢中起着重要作用。GSTs活性的提高是许多昆虫对有机磷等杀虫剂产生抗性的重要机理之一。 GST活力测定可用谷胱甘肽和1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)或DCNB作底物, 反应后用分光光度计在340 nm波长下测光密度值(A)。 Bull等发现烟蚜夜蛾对甲基对硫磷的抗性与谷胱甘肽-S-转移酶的活力升高有关。 Ku等在小菜蛾中分离到4种与抗性相关的谷胱甘肽-S-转移酶同工酶,其中GST-4和DCNB与几种有机磷药剂对氧磷有更高的底物亲和力。
2.3.3 多功能氧化酶系
      多功能氧化酶系(MFOs)包括细胞色素P450、NADPH-细胞色素P-450还原酶、 细胞色素b-5、NADH-细胞色素b-5还原酶、芳烃羟化酶、环氧化物水化酶以及磷脂等,细胞色素P450在MFOs系统中起中心作用。 P450具有底物广泛性和功能多样性的特点,在多种内源性及外源性化合物的氧化、环氧化及还原等代谢过程中发挥重要作用。 在昆虫体内中,多功能氧化酶(MFO)主要分布于中肠、脂肪体和马氏管,其中以中肠的活力最高,这种分布使其最大限度地发挥作用,杀虫剂在有些昆虫中还未到达靶标就被酶解。
      MFO活性升高是许多昆虫代谢杀虫剂产生抗药性的重要机理。 在棉铃虫的抗氰戊菊酯品系、抗溴氰菊酯品系、抗辛硫磷品系,蜚蠊抗氰戊菊酯品系中都发现了增效剂PBO的明显增效作用或MFOs活性的提高,这些研究结果都从生化的角度证明了MFOs在害虫对各种杀虫剂产生抗性中的重要作用。 程罗根等采用室内选育的小菜蛾对杀螟丹的抗性品系和敏感品系进行研究,得出小菜蛾MFO环氧化活性的提高是小菜蛾对杀螟丹产生抗性的一个重要机制。梁沛等用叶片药膜法测定了增效醚(PB)对阿维菌素增效达8.2倍,可见小菜蛾对阿维菌素的抗性可能与MFO有密切关系。 刘永杰等发现甜菜夜蛾抗性品系中肠、脂肪体及体壁细胞色素P450含量分别是敏感品系的1.78、1.54和1.37倍。
2.3.4 乙酰胆碱酯酶
      乙酰胆碱酯酶 (AchE)是有机磷和氨基甲酸酯的共同靶标,AChE发生变构会导致害虫的AChE对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抑制表现的不敏感而产生抗药性。由于有机磷类和氨基甲酸酯类杀虫剂能使AChE发生磷酰化或氨基甲酰化,从而抑制了AChE的活性,导致神经递质乙酰胆碱(Ach)在突触处积累,过量的ACh造成去极化阻断,抑制了正常的神经传导,最终造成昆虫死亡。 第一个被证明因AChE变构引起敏感性降低而成为抗性机理的是羊绿蝇抗性品系。之后又陆续在棉蚜、棉粉虱、小菜蛾、阿拉伯按蚊、家蝇、地中海实蝇、黄猩猩果蝇、尖音库蚊、马铃薯甲虫等20多种昆虫中陆续发现和证实。
      有文献报道, 昆虫体内AChE的突变、AChE量的增加都可能与昆虫抗性成正比。杨帆等研究了桃蚜高效氯氰菊酯敏感品系与抗性品系体内的AChE活力,抗性品系AChE活性均显著高于敏感品系;酶动力学测定结果显示,抗性桃蚜酯酶对底物的Vmax、Km显著大于敏感品系。在果蝇中,AChE的过量产生导致了对马拉硫磷的高水平抗性。有机磷抗性麦二叉蚜AChE活性显著高于敏感个体,通过分析表明,抗性个体AChE活性不是由于基因突变造成的,而是由于基因表达量增加所致。
2.4其他检测方法
      利用害虫的趋性来监测其抗药性有两种方法,一种是用黄色诱卡,一种是用性外激素做成诱卡。这两种方法的原理均是将不同剂量的杀虫剂与粘性材料混合,然后涂在有诱源的卡片上,检查诱集到的害虫死亡率和剂量的关系,求出LC50值或其他参数值。利用害虫的趋性监测抗药性省去了对试虫的饲养。
      此外,随着生物化学和分子生物学的快速发展而产生了一系列新的抗药性监测技术,如免疫学检测法、神经电生理检测法、抗性基因检测法等。新的抗性监测技术与传统的生物检测法相比具有更多优点,其本身也正朝着程序化、自动化方向发展,但该类方法是建立在对抗药性的生理生化机制、分子机制深刻认识基础之上,其开发周期长,花费较大,需要昂贵的仪器,且目前的方法仅针对由单一抗性机制所引起的抗性监测。 因此,新的方法还无法直接应用于现场害虫抗药性检测,只能作为生物测定方法的辅助手段。
3结束语
      农药自问世以来,以其良好的杀虫、杀菌效果为人们所接受,但随着农药尤其是化学农药的大量使用,其带来的种种问题也越来越受到人们重视,关于是否应该继续使用农药,应该怎样使用农药逐渐成为人们争论的焦点。在农药使用所带来的问题中,抗药性的产生是其核心问题。 正是由于抗药性的存在且不断增强,才使得人们不断地增加农药用量,于是直接或间接导致了其他一系列更为严重的后果。可见,在农药学研究中,对害虫抗药性发展的及时掌握是一项极其重要的基础工作。
      杀虫剂与害虫之间的作用是相互的,杀虫剂可以导致害虫个体死亡,但同时也会使害虫种群产生相应的抗性。对害虫抗药性变化动态进行密切的跟踪监测,是预防抗药性发展,进一步制定出抗性治理方案的重要依据。 害虫的抗性监测中,监测方法的选择尤为重要。目前抗性监测工作分为群体监测和个体监测两个工作面,群体监测在于掌握抗性现状及抗性谱,有利于制定防制对策;个体监测则在于了解群体中抗性基因的分布频率,预测抗性发展动态。理想的抗药性监测工作是把这两个工作面有机结合,如建立分子检测结果与生物测定结果之间的数学模型,并根据分子检测结果预测害虫种群的抗性水平,实现对害虫种群抗性的分子监测,从而制定最切合实际的防治方案。但就目前的研究水平而言, 对于这些方面的把握仍存在一些欠缺,因此,抗药性监测研究方法的进一步改善与合理应用仍有待科研工作者更为深入的研究。(文章由植保会整理,转载请注明!)

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