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海金沙孢子的培养繁殖过程研究

来源:http://www.zhibao17.com/ 更新时间:2013-02-05 阅览4594次

      海金沙是常见的藏类植物。它属于旅类植物门、薄囊威纲、直藏目、海金沙科、海金沙属,分布于热带和亚热带地区,北至陕西及河南南部,西达四川、云南与贵州。全草或者成熟孢子可供药用,味甘淡,性寒,有清热解毒,利水通淋的功效植株具缠绕习性,是垂直绿化的好材料,其所含成分较为复杂,具有生物活性成分主要有酚类化合物、黄酮类、生物碱类、幽体及三菇类化合物等.试验表明:海金沙袍子50%的乙醇提取物具有显著的抗雄性激素作用,海金沙醇提物对藤黄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和乙型溶血性链球菌等均有较好的抑菌效果,此外,还发现海金沙具有抗流感病毒、HIV-1病毒、辛德毕斯病毒等的作用。
      近年来,国内外学者曾做过海金沙配子体的培养与观察,海金沙游动精子的形态发生及多层结构,胚胎发育的研究及中国旅类植物孢子形态的研究工作,但尚未见对海金沙的孢子体繁殖方法做研究的报道。本文对孢子捕捉器捕捉的海金沙的孢子体繁殖技术进行研究,为大规模快速繁殖海金沙提供科学依据。截至目前,在12000种旅类植物中,成功进行组织培养的仅占极少一部分,且主要集中在肾族、鹿角藏、凤尾威等少数属种中.因此,这也为以后整个藏类植物进行快速繁殖的研究提供理论参考和依据。
      海金沙孢子体叶(附带成熟孢子)于2008年11月上旬采自湖北省恩施市湖北民族学院后山,作为海金沙孢子体组织培养材料。取带有成熟袍子体叶作为外植体,用清洁剂清洗2~3次,用自来水冲洗2h,放人75%的乙醇中快速浸沾30s,然后置于0.01%升汞中2-3min或10%双氧水灭菌5-10min亦可;取出用无菌水冲洗5-6遍后将无菌的外植体剪成适合大小(一般0.5cm左右)的小块接种于培养基上。
      诱导孢子体叶分化形成GGB.以MS为基本培养基,加人蔗糖3%,琼脂6.5g•L-(若无特殊说明,下同),把6-BA以0.5,0.7,1.0mg•L,和NAA以0.1,0.3,0.5mg•L,的浓度随机组合,一共9个处理,取带有成熟孢子体叶分别接种于上述培养基中。诱导GGB分化形成幼苗.以MS为基本培养基,把6-BA分别以。,1.0,1.5,2.0mg•L,的浓度和NaHZP04以100,200mg•L的浓度随机组合,8个处理。诱导生根培养基.分别对蔗糖含量和NAA,IBA浓度对生根的影响进行试验。炼苗及移栽。①炼苗.经过生根培养的幼苗在生长状况良好的条件下,逐渐地打开瓶盖,每天向叶片及基质喷洒水分,以保持培养瓶中的湿度在65%左右,使幼苗能正常生长。7d后,就可以完全去掉瓶盖,再在培养室中培养l0d,然后移栽到准备好的基质中。②移栽.移栽基质的准备:以珍珠岩:草炭=2:1混合,分别装到花钵中备用。幼苗练好后,就可以移栽到上述准备好的培养基质中并用薄膜覆盖在花钵上以保持基质湿度。孢子体叶接种到培养基上培养15d后,孢子体叶的边缘渐渐出现像青苔一样的小绿色球状体继续在培养基4上培养20d后,GGB逐渐长大,并看到有少许的叶长出。可知选用MS十NAA0.3m岁L+6-BA0.5mg/L为诱导产生GGB的最佳方案,分化率达90%。由结果可以看出,在NAA浓度较低时,随着6-BA浓度的上升,体细胞的分化率先上升后下降,说明高浓度的6-BA会抑制体细胞的分化;同理,在6-BA浓度较低时,高浓度的NAA也会抑制体细胞的分化.由方差分析表明,NAA对体细胞分化为GGB的影响极显著(P<0.01),而6-BA对体细胞分化为GGB的影响无论是P<0.01还是P<0.05都不显著.这说明NAA对海金沙体细胞的分化有较大的促进作用。
      不同条件对GGB增殖分化为幼苗的影响:不同浓度的6-BA和NaH2P04对GGB增殖分化为幼苗的影响结果。将诱导出的GGB转接到表2的培养基上,10d后可以看到有小叶长出,再过5d可以看到分化的茎.继续培养,并将分化出的幼苗进行分株以扩大繁殖,第6组MS+6-BA1.5mg/L+NaHzP04200mL为最佳诱导GGB分化增。
      为了探讨出更佳的生根培养方案,进行了以下的预试验:将IBA与NAA以不同的浓度进行组合,结果发现组合的配方更有利于诱导GGB分化形成茎和叶,而根的生长比较缓慢;培养基配方中加人0.3%的活性炭,结果发现幼苗的根比在没有加活性炭的培养基中长得快,但不如没有加活性炭的培养基中的根多和粗壮.由此说明,NAA对生根无明显的促进作用而活性炭则有利于生根.但李玉平等在圆齿野鸦椿种子外植体的快繁体系研究中得出低浓度的IBA与NAA的组合使其生根率达95%。这也说明,不同的植物在生长过程的同一阶段对激素的需求水平是不一样的。
      周索在研究翠菊“花束绊红”时得出由不定芽诱导生根的培养基是1/2MS+IBAO.Img•L-1,这与此研究的结果一致,低浓度的IBA有利于促进生根。海金沙的野生植物资源,由于受到生境及其自身繁殖的限制,如今已不能满足市场需求,本文旨在通过实验室的组织培养技术研究出其扩大繁殖的方法和途径,以便于用来工厂化生产扩大海金沙的来源,以供应市场需求。同时,也为威类植物的袍子叶繁殖提供了参考依据。
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